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濕法珠磨制備米諾地爾納米顆粒實現高效靶向毛囊

 更新時間:2024-04-15  點擊量:301



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全文共 5735 字,閱讀大約需要 18分鐘


摘要:蛋黃米諾地爾,一款備受矚目的生發神器,正以其技術和成分,幫助越來越多的人重拾濃密秀發。Oaku團隊致力于通過納米技術,特別是通過珠磨法制備了5%MXD納米顆粒制劑(MXD-NPs)。該配方既具有MXD納米顆粒的分散性,又通過使用靶向毛囊的納米顆粒來增強毛發生長效果,從而解決MXD治療AGA中的療效和安全性之間的平衡問題。



1

探秘生發神器——米諾地爾的前世今生

米諾地爾,一款備受矚目的生發神器,正以其技術和成分,幫助越來越多的人重拾濃密秀發。這款產品以古代文明米諾斯王國的名字命名,寓意著恢復頭發生長的神奇力量。


作為目前暢銷的生發藥物,米諾地爾的出現卻充斥著意外。在被發現這款藥物針對脫發的強大療效之前,它還僅僅是一款治療高血壓的臨床藥物。


不過,在上世紀70年代,醫生們意外發現了米諾地爾的另類副作用:可讓高血壓患者重新長出毛發。這個意外發現,幾乎一舉扭轉了人類治療脫發無專用藥物的尷尬局面。


米諾地爾(英語:Minoxidil)是一種鉀通道開放藥,這類藥物在降壓時常伴有反射性心動過速和心輸出量的增加。對于血管擴張的作用具有選擇性,見于冠狀動脈,胃腸道血管和腦血管,而不擴張腎和皮膚血管。它還可以減低或停止掉發并且促進毛發再生。在實際應用中,米諾地爾是美國FDA認可有效治療脫發的外用藥物,在全球近百個國家都活躍著它的身影。[1]


米諾地爾主要有酊劑、擦劑、噴霧劑和泡沫劑等劑型,臨床中酊劑和擦劑更為常用。按照藥物含量分類,又可以分為2%濃度和5%濃度兩種,2%的劑型多用于女性和兒童,5%的劑型多用于男性,女性也同樣可以使用。


截止2022年,中國脫發患病人數達到2.53億人,預計2030年,中國的脫發人群數量將增長至2.58億人左右。足見米諾地爾在中國的市場潛力巨大。[2]


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米諾地爾制備挑戰——療效和安全性的平衡

然而,目前上市的米諾地爾也面臨著一些挑戰:在治療雄激素性脫發(AGA)過程中,不同濃度的米諾地爾(MXD)對毛發生長效果的差異性研究不夠充分、高濃度MXD可能帶來的不良反應風險也尚未探明。


科研人員一直致力于克服這些問題。


Oaku團隊專注于運用納米技術,特別是通過珠磨法成功制備了含有5%MXD的納米顆粒制劑(MXD-NPs)。這一制劑不僅繼承了MXD納米顆粒的良好分散性,還通過靶向毛囊的納米顆粒,顯著增強了毛發生長的效果,從而巧妙地平衡了MXD在治療雄激素性脫發(AGA)中的療效與安全性問題。


MXD配方的性能受到其平均粒徑、溶解度、粘度和Zeta電位等參數的深刻影響。藥物在制劑中的溶解狀態有助于其滲透角質層,深入皮膚組織乃至血液循環。然而,納米顆粒若尺寸過大,則難以通過角質層,從而限制了其滲透效果。值得欣喜的是,MXD納米顆粒能夠精準地靶向毛囊,因此在促進毛發生長方面,其效果遠勝于傳統的商業化MXD溶液。此外,納米顆粒還顯著提高了MXD在上部毛囊中的含量,并激活了毛囊干細胞,這一創新策略有望大幅提升MXD在治療雄激素性脫發中的療效和安全性。


因此,如何高效地制備出粒徑適中、均一性好、分散性強且穩定性高的MXD納米顆粒,成為了當前研究的重中之重。本文旨在簡要介紹Oaku課題組在此方面的實驗進展,以期為讀者提供有關這一領域的最新動態。[3]




3

實驗方案步驟:

制備MXD納米粒子分散體

  • MXD-NPs制備:

    將MXD粉末和MC(用于增強MXD納米粒子的分散性并提高珠磨機的粉碎效率)混合,然后使用瑪瑙研缽在4℃條件下研磨1.5小時,并將混合物(MXD 5g 和 MC 8g)懸浮在100 mL含有甲基p的純化水中,使用羥基苯甲酸酯(0.026%)和對羥基苯甲酸丙酯(0.014%)作為防腐劑。將分散體裝在有氧化鋯珠(直徑為0.1mm)的2mL管中攪拌。

    之后,通過超聲波處理5分鐘以及珠磨機研磨30秒。超聲波和珠磨機處理在4℃下交替重復30次。

    此外,使用臺式珠子粉碎機粉碎研磨分散體120分鐘,并將獲得的分散體用作MXD-NPs。


  • MXD-MPs制備:

    具有相同成分的未研磨分散體(5%MXD、8%MC、0.026%對羥基苯甲酸甲酯和 0.014% 對羥基苯甲酸丙酯添加到純水中)被定義為MXD-MPs(對照組),并且兩種 MXD 制劑的pH值均調整至6.8。



表征

  1. MXD含量檢測——液相色譜(HPLC)

  2. 粒度檢測——納米粒度儀(DLS)、納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)、原子力顯微鏡(AFM)

  3. Zeta電位檢測——Zeta電位分析儀(ELS)

  4. 生發效果評估

    4.1 數碼相機拍攝——實驗前2天剃除C57BL/6小鼠背部毛發,然后每天一次將MXD制劑重復應用于C57BL/6小鼠的· 4.2 背部區域,并每天使用數碼相機拍攝毛發生長。

    4.3 毛囊中IGF-1和VEGF蛋白測試——酶標儀測定吸光度

    4.4 皮膚組織、毛發隆起、毛球和血液中的MXD含量測量——HPLC、蛋白質測定試劑盒。

    4.5 通過HE和免疫染色來評定毛發生長效果——顯微鏡。



結果討論

實驗采用珠磨法成功制備了含有5%MXD固體納米粒子的分散體。為了提高MXD納米粒子的分散性,并避免藥物濃度上升導致制劑中分散顆粒的加速聚集,研究人員特別添加了高甲基纖維素(MC)。在本次試驗中,選用了8%的MC含量來制備MXD-NPs,即含有5%MXD固體納米粒子的懸浮液,從而有效防止了MXD固體納米顆粒在制劑中的聚集。

同時,研究人員還測量了MXD配方的平均粒徑、溶解度、粘度和zeta電位等關鍵參數(如下表1所示),以便更全面地了解和分析其性能。


表1.MXD-MPs 和 MXD-NPs平均粒徑、溶解度、粘度和 zeta 電位對比


此外,制備的MXD納米粒子分散體的穩定性也是重點評估指標。通過追蹤14天外觀的變化,以及測定體系中MXD含量來評估其穩定性,結果如下圖1和圖2所示。由結果可知,MXD-NPs具有更好的長期穩定性。


圖1.MXD-MPs 和 MXD-NPs存放14天實物圖


圖2.MXD-MPs 和 MXD-NPs存放14天MXD含量變化曲線圖



通過C57BL/6小鼠背部毛發實驗,進一步評估不同樣品生發效果。其結果見圖3和圖4。


Vehicle            MXD-MPs        MXD-NPs          CA-MXD

圖3.MXD制劑對C57BL/6小鼠重復處理(每天1次)的數碼照片。從上至下依次為第1、8、10天記錄照片;MXD制劑依次為:Vehicle(載體,僅使用用于制備MXD-MPs和MXD-NPs制劑的載體。)、MXD-MPs和MXD-NPs、CA-MXD(市售MXD溶液)


Vehicle            MXD-MPs        MXD-NPs          CA-MXD

圖4.反復應用MXD制劑(每天1次)8 d和10 d后C57BL/6小鼠皮膚橫切面圖像。從上至下依次為第8、10天記錄照片;MXD制劑依次為:Vehicle(載體,僅使用用于制備MXD-MPs和MXD-NPs制劑的載體。)、MXD-MPs和MXD-NPs、CA-MXD(市售MXD溶液)


通過圖3和圖4結果可知,MXD-NPs配方比CA-MXD配方更早產生了頭發生長。對于這一現象,進一步對毛囊傳遞途徑進行了新的評估,將毛囊分為上部(毛囊隆起區)和下部(毛囊球)??砂l現MXD-NPs處理的小鼠的毛囊隆起區中的MXD濃度高于CA-MXD處理的小鼠,而MXD-NPs處理的小鼠的毛囊球和皮膚組織中的MXD含量低于CA-MXD處理的小鼠(圖5)。


另外,在MXD-NPs處理的小鼠的血液中沒有檢測到MXD(圖5)。通常認為藥物通過連續的角質層(SC)或通過附屬物穿透皮膚。Nagai等人報道過平均直徑約為200 nm的納米顆粒通過角質層阻止了納米顆粒的滲透。溶解在制劑中的藥物被認為會滲透角質層并深入皮膚組織以及血液中。


在本實驗中,MXD-NPs的粒徑為70-200 nm,這些納米顆??赡茈y以通過角質層。MXD-NPs中固體MXD的比例超過99%,這意味著只有很少量的MXD能夠滲透角質層。這可能解釋了MXD-NPs處理的小鼠皮膚組織和血液中MXD含量較低的現象。另外,納米顆??赡芡ㄟ^毛囊孔道遷入毛囊,增強MXD治療脫發的療效,提高患者在療效和安全性方面的滿意度。


圖5. 在MXD制劑應用后的4小時內,C57BL/6小鼠的皮膚組織(A),毛囊隆起區(B),毛囊球(C)和血液(D)中的MXD含量。n = 4-12。MXD-MPs,應用MXD-MPs的小鼠。MXD-NPs,應用MXD-NPs的小鼠。CA-MXD,應用CA-MXD的小鼠。N.D.,不可檢測。* p < 0.05與每組MXD-MPs相比。#p < 0.05與每組CA-MXD相比。


這些研究結果表明,與毛囊中的MXD含量相比,毛囊隆起區中的MXD含量可能與促進頭發生長的效果更強相關。隆起區的細胞具有干細胞特性,并能產生次級胚細胞,在生長期開始時產生新的毛干[38]。假設注入到毛囊隆起區的MXD激活了毛囊上皮干細胞。因此,進一步進行了免疫組織化學染色來評估表達CD200的干細胞的增殖和激活情況。結果顯示,在接受MXD-NPs處理的小鼠中,CD200的表達觀察到在隆起區和亞隆起區,而在接受CA-MXD處理的小鼠中,CD200只在毛囊隆起區的一個更有限的區域內觀察到(圖6)。


圖6.MXD制劑對C57BL/6小鼠皮膚組織(毛囊隆起區和毛囊球)的顯微效果,在重復使用開始后的8天(每天一次)。(A) C57BL/6小鼠皮膚組織標本的H&E染色圖像(條狀刻度表示100µm);(B) 圖A中方框所示區域的高倍顯微鏡圖像(條狀刻度表表示50µm);(C)圖A中顯示的連續片段的CD200免疫染色的光學圖像(條狀刻度表表示100µm);(D)圖C中方框所示區域的高倍顯微鏡圖像(條狀刻度表表示50µm)。箭頭表示CD200的表達。CD200染成棕色;與CA-MXD組相比,MXD-NPs組中的CD200表達增強。


綜上所述,這些結果表明,MXD-NPs將高MXD含量傳遞到毛囊隆起區,可能導致毛囊上皮干細胞的增殖和激活,從而增強頭發生長的效果(圖7)。然而,目前對于MXD如何促進頭發生長的理解還很有限,對于MXD與干細胞之間的直接相互作用也知之甚少。MXD納米顆粒粒徑,穩定性作用機制有待進一步研究。


圖7.MXD-MPs(粉末型)、MXD-NPs(納米顆粒型)和CA-MXD(溶液型)配方向毛囊隆起區和毛囊球區域輸送藥物的示意圖。


總結

Oaku團隊成功開發了一種含有5%米諾地爾(MXD)的納米顆粒制劑,用于增強小鼠的毛發生長。這項研究為我們展示了納米技術在藥物輸送中的巨大潛力。

在實驗中,MXD納米顆粒表現出了顯著的優勢。與商業化MXD溶液相比,MXD納米顆粒能夠更高效地靶向毛囊,導致了更加顯著的毛發生長。研究結果顯示,MXD納米顆粒使得MXD在上部毛囊中的含量顯著增加,進而激活了毛囊干細胞,為雄激素性脫發的治療提供了新的可能性。



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HM&M珠磨機

常見分散方法的球磨法或砂磨機,在分散時物料、磨珠與機體之間的撞擊會對納米晶、混懸劑中的納米顆粒造成損傷,磨損的材料進入料液中會變成難以除去的雜質,這對料液的純度產生不利的影響,此外,機械力過大時局部升溫過快,也會導致物料的不穩定,影響后續的使用。


日本HM&M珠磨機的UAM機型采用立式珠磨設計,使得流經腔體的物料能獲得充分的珠磨分散和破碎,獲得更為均一體系。同時,UAM也是世界上采用離心分離方式分離磨珠的珠磨機。利用離心力將磨珠和漿液分離,因此不需要考慮漿液出口處的間隙大小,即使是使用微珠,也不會發生堵塞。UAM是第一臺用于納米分散的珠磨機,并用于商業生產,可適用于細至15μm的微珠,這是目前最小的磨珠。UAM不僅適用于微珠,還適用于1mm的較大磨珠,適用范圍廣,可應用于亞微米粒子的粉碎或納米粒子的分散等多個領域。同時,設計簡單,易于拆卸和組裝。也容易回收殘留在研磨腔體中的漿料。


  • 可使用微小磨珠進行連續分散和粉碎處理離心式珠料分離器,能應對各種磨珠粒徑

  • 磨珠切換簡單,操作便利

  • 拆卸和組裝操作便利,易于回收漿料

  • 具有良好的清潔性,方便應對物料切換


圖8. HM&M珠磨機


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高壓微射流均質機

PSI-20高壓微射流均質機(小試兼中試型)采用固定結構的均質腔,通過電液傳動的增壓器使物料在高壓作用下以極大的速度流經交互容腔的微管通道,物料流在此過程中受到高剪切力、高碰撞力、空穴效應等物理作用,使得平均粒徑降低、體系均一穩定,由此獲得理想的均質、分散、去團聚的結果。

  • 最高2069 bar的均質壓力,最高處理量20L/h (PSI-20)

  • 采用特殊設計Y型腔,去除尾端大顆粒效果佳,物料的混合更均一,處理效率高。

  • 屏顯界面,數據可溯源:支持數據導出設定壓力及實時壓力、監測點溫度、實時流量、時間等。

  • 配置K型熱電偶:可用于實施監測料液溫度。

  • 低噪音:運行音量低于70分貝,工作環境友好型。

圖9.PSI-40 高壓微射流均質機


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平均粒徑檢測

難溶性藥物,如米諾地爾的粒徑對其后續藥用效果具有很大影響。溶解在制劑中的藥物滲透角質層并深入皮膚組織以及血液中,而過大尺寸的納米顆粒則難以透過角質層,進而阻止了納米顆粒的滲透。MXD納米顆??梢愿咝У匕邢蛎?,導致毛發生長比商業化MXD溶液更為顯著。此外,納米顆粒使得MXD在上部毛囊中的含量顯著增加,并激活毛囊干細胞,因此,需要制備尺寸均一,分散性好的納米顆粒用于有效的提高生發效果。

Nicomp納米激光粒度儀系列

Nicomp系列納米激光粒度儀采用動態光散射原理檢測分析樣品的粒度分布,基于多普勒電泳光散射原理檢測ZETA電位。

圖10. Nicomp 3000系列(實驗室)

  • 粒徑檢測范圍0.3nm-10μm,ZETA電位檢測范圍為+/-500mV

  • 搭載Nicomp多峰算法,可以實時切換成多峰分布觀察各部分的粒徑。

  • 高分辨率的納米檢測,Nicomp納米激光粒度儀對于小于10nm的粒子仍然現實較好的分辨率和準確度。


圖10.1∶高斯粒徑分布圖

圖10.2∶Nicomp多峰粒徑分布圖


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尾端大粒子濃度檢測

而過大尺寸的納米顆粒則難以透過角質層,進而阻止了納米顆粒的滲透。MXD納米顆??梢愿咝У匕邢蛎?,導致毛發生長比商業化MXD溶液更為顯著。因此,對于大顆粒(尾端大粒子)的監控,對于篩選并優化米諾地爾配方,成品檢測具有重要意義。

AccuSizer顆粒計數器系列

AccuSizer系列在檢測液體中顆粒數量的同時精確檢測顆粒的粒度及粒度分布,通過搭配不同傳感器、進樣器,適配不同的樣本的測試需求,能快速而準確地測量顆粒粒徑以及顆粒數量/濃度。

圖11.  AccuSizer A7000系列

  • 檢測范圍為0.5μm-400μm(可將下限拓展至0.15μm)。

  • 0.01μm的超高分辨率,AccuSizer系列具有1024個數據通道,能反映復雜樣品的細微差異,為研發及品控保駕護航。

  • 靈敏度高達10PPT級別,即使只有微量的顆粒通過傳感器,也可以精準檢測出來。


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穩定性分析檢測

米諾地爾屬于難溶性藥物,其粒徑在亞微米到微米級別,分散體系如果穩定性差,可較短時間內發生沉降分層。在實際使用過程中,穩定性的差異也會影響產品均一性,產品中納米顆粒粒徑的情況。而納米顆粒的粒徑大小會直接影響其生發效果,是否會滲透,是否會被角質層阻隔,是否在毛囊中積累等。因此,在米諾地爾配方選擇及工藝優化階段,穩定性的評估非常重要,通過快速評估穩定性,可在研發階段對不同米諾地爾配方進行篩選,對工藝進行優化,大大縮短研發時間。

LUM穩定性分析儀

LumiFuge穩定性分析儀可以直接測量整個樣品的分散體的穩定性,檢測和區分各種不穩定現象,如上浮、絮凝、聚集、聚結、沉降等,通過測量結果可用來開發新的配方和優化現有的配方及工藝。

圖12. LUM穩定性分析儀系列

  • 快速、直接測試穩定性,無需稀釋,溫度范圍寬廣

  • 可同時測8個樣品,測量及辨別不同的不穩定現象及不穩定性指數

  • 加速離心,最高等效2300倍重力加速度


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過濾

在米諾地爾制備過程中,過濾可有效去除米諾地爾中的尾端大顆粒和其他雜質,使得樣品體系更為均一。過濾時使用不同的膜將會影響物理攔截,吸附攔截等效果,需根據不同的工藝選擇能相容該產品的濾芯。

Entegris濾芯

Entegris-Anow是一家高分子微孔膜過濾企業,專業從事MCE、Nylon、PES、PVDF、PTFE等(膜孔徑為0.03μm~10μm)微孔膜的研發及生產,具有二十多年服務與醫藥客戶經驗,并為全球生物制藥、醫療器械、食品飲料、實驗室分析、微電子及工業等領域的客戶提供過濾、分離和凈化解決方案。



參考資料:

[1] A. K. Gupta, M. Talukder, M. Venkataraman, et al. Minoxidil: a comprehensive review[J]. Journal of Dermatological Treatment,2021, DOI:10.1080/09546634.2021.1945527]

[2] 中國米諾地爾行業發展深度分析與投資前景預測報告(2023-2030年)

[3] Oaku Y, Abe A, Sasano Y, Sasaki F, Kubota C, Yamamoto N, Nagahama T, Nagai N. Minoxidil Nanoparticles Targeting Hair Follicles Enhance Hair Growth in C57BL/6 Mice. Pharmaceutics. 2022 Apr 27;14(5):947. doi: 10.3390/pharmaceutics14050947. PMID: 35631533; PMCID: PMC9145891.

[4] Barry, B.W. Novel mechanisms and devices to enable successful transdermal drug delivery. Eur. J. Pharm. Sci. 2001, 14, 101–114.

[5] Nagai, N.; Ito, Y. Excessive hydrogen peroxide enhances the attachment of amyloid β1-42 in the lens epithelium of UPL rats, a hereditary model for cataracts. Toxicology 2014, 315, 55–64.

[6] Nagai, N.; Iwai, Y.; Sakamoto, A.; Otake, H.; Oaku, Y.; Abe, A.; Nagahama, T. Drug delivery system based on minoxidil nanoparticles promotes hair growth in C57BL/6 mice. Int. J. Nanomed. 2019, 14, 7921–7931.

[7] Garza, L.A.; Yang, C.C.; Zhao, T.; Blatt, H.B.; Lee, M.; He, H.; Stanton, D.C.; Carrasco, L.; Spiegel, J.H.; Tobias, J.W.; et al. Bald scalp in men with androgenetic alopecia retains hair follicle stem cells but lacks CD200-rich and CD34-positive hair follicle progenitor cells. J. Clin. Investig. 2011, 121, 613–622.




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